1-2- ترکیبات شیر………………………………………………………………………………………………………………… 4
1-3- پروتئینهای شیر…………………………………………………………………………………………………………. 5
1-3-1- پروتئینهای آب پنیر………………………………………………………………………………………… 6
1-3-2- کازئینها…………………………………………………………………………………………………………….. 7
1-3-3- کازئینبتا…………………………………………………………………………………………………………….. 9
1-4- فعالیتهای زیستی کازئینها…………………………………………………………………………………….. 11
1-4-1- فعالیت چاپرون کازئینهای شیر…………………………………………………………………….. 11
1-4-2- پپتیدهای فعال زیستی……………………………………………………………………………………. 12
1-4-2-1- پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………………………………………. 12
1-4-2-2- منابع اصلی پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………………….. 12
1-4-2-3- برخی از خواص پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………….. 12
1-4-2-3-1- خاصیت ضد فشار خون……………………………………………………………… 12
1-4-2-3-2- فعالیت آنتیاکسیدانی………………………………………………………………… 14
1-5- مشکلات ناشی از مصرف شیر در افراد…………………………………………………………………….. 15
1-5-1- عدم تحمل لاکتوز……………………………………………………………………………………………. 15
1-5-2- آلرژی به پروتئینهای شیر……………………………………………………………………………… 16
عنوان صفحه
1-5-2-1- معرفی انواع آزمونهای رایج جهت مطالعهی فرآیند آلرژی……………… 18
1-5-2-2- آزمون الایزا……………………………………………………………………………………………. 19
1-6- قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها……………………………………………………………………………. 20
فصل دوم: مروری بر پژوهشهای پیشین………………………………………. 23
فصل سوم: مواد و روشهای تحقیق
3-1- مواد مصرفی………………………………………………………………………………………… 27
3-2- تهیهی محلولها……………………………………………………………………………. 28
3-2-1- تهیهی محلولهای کازئینی، کازئینبتا و تعیین غلظت آنها………………………. 28
3-2-2- تهیهی محلول برادفورد و رسم نمودار استاندارد آن با
استفاده از کازئینبتا……………………………………………………………………………. 28
3-2-3- تهیهی محلولهای مورد نیاز برای الکتروفورز ژلی………………………………………… 30
3-2-3-1-تهیه محلول SDS 20 درصد………………………………………………………………… 30
3-2-3-2- تهیه محلول آمونیوم پر سولفات (APS)……………………………………………… 30
3-2-3-3- تهیه محلول آکریلامید و بیس آکریلامید…………………………………………… 31
3-2-3-4- تهیه بافر تریس 5/1 مولار…………………………………………………………………… 31
3-2-3-5- تهیه بافر تریس 5/0 مولار…………………………………………………………………… 31
3-2-3-6- تهیه بافر تانک به حجم 500 میلیلیتر……………………………………………… 31
3-2-3-7- تهیه بافر نمونه X2………………………………………………………………………………. 32
3-2-3-8- تهیه 100 میلیلیتر محلول کوماسیبلو……………………………………………… 33
3-2-3-9- تهیه محلول رنگ بر ژل………………………………………………………………………… 33
3-2-4- تهیه محلول OPA به حجم 50 میلیلیتر……………………………………………………. 33
3-2-5- تهیه محلول فلورسامین…………………………………………………………………………………… 34
عنوان صفحه
3-2-6- تهیه محلول ANS…………………………………………………………………………………………… 35
3-2-7- تهیه محلول ABTS رادیکال…………………………………………………………………………. 36
3-2-8- تهیه عصارهی ACE از پودر استون شش خرگوش……………………………………… 37
3-3-روشها………………………………………………………………………………………… 38
3-3-1- تخلیص کازئینبتا شیرگاو……………………………………………………………………………….. 38
3-3-2- تخلیص هموگلوبین A از خون انسان……………………………………………………………. 39
3-3-3- تعیین میزان خلوص پروتئین با استفاده از SDS-PAGE…………………………… 40
3-3-4- تهیه پودر استون شش خرگوش…………………………………………………………………….. 40
3-3-5- قندی کردن کازئینبتا و کازئینهای شیرگاو به روش غیرآنزیمی………………. 41
3-3-6- آزمونهای OPA و فلورسامین برای تایید فرآیند
قندی شدن غیرآنزیمی………………………………………………………….. 41
3-3-7- مطالعهی فلورسانس ذاتی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی……………………. 42
3-3-8- مطالعهی فلورسانس عارضی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی……………….. 43
3-3-9- مطالعه تغییرات ساختاری کازئینهای بتای قندی و غیرقندی،
با استفاده از دستگاه دورنگ نمایی دورانی………………………………………. 43
3-3-10- مطالعهی فعالیت چاپرونی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی………………… 44
3-3-11- هضم کازئینهای شیرگاو و کازئینبتای قندی و غیرقندی
به وسیلهی آنزیمهای تریپسین و کیموتریپسین پانکراس گاوی…………………………………. 44
3-3-12- مطالعهی فعالیت آنتیاکسیدانی کازئینهای شیرگاو کازئینبتای
قندی و غیرقندی…………………………………………………………………………. 45
3-3-13- مطالعهی فعالیت مهار آنزیم ACE به وسیلهی کازئینبتا
قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آنها……………………………………… 47
3-3-14- مطالعهی توان آلرژیزایی کازئینها و کازئینبتای قندی
و غیرقندی……. 47
عنوان صفحه
3-3-15- آزمون آماری…………………………………………………………………….. 48
فصل چهارم: نتایج و بحث
4-1- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیتهای زیستی
(چاپرونی، آنتیاکسیدانی و مهار آنزیمACE ) و آلرژیزایی کازئینبتا………………………………. 50
4-1-1- تخلیص پروتئین کازئینبتا………………………………………………………………………………. 50
4-1-2- تخلیص هموگلوبینA از خون انسان……………………………………………………………… 51
4-1-3- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئینبتا
در حضور مادهی احیا کننده………………………………………………… 52
4-1-3-1- مطالعهی قندی شدن کازئینبتا با استفاده از ترکیب OPA……………… 53
4-1-3-2- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئینبتا با استفاده
از ترکیب فلورسامین…………………………………………….. 54
4-1-3-3- استفاده از ژل SDS-PAGE احیایی برای تایید فرآیند
قندی شدن غیرآنزیمی کازئینبتا……………………………………………………………………………… 55
4-1-4- مطالعهی فلورسانس ذاتی و عارضی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی…… 56
4-1-5- مطالعه ساختار دوم کازئینهای بتای قندی و غیرقندی با استفاده
از دستگاه دورنگ نمایی دورانی………………………………………………………………………………………. 58
4-1-6- مطالعه فعالیت چاپرونی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی………………………. 60
4-1-7- هضم آنزیمی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی با آنزیمهای
تریپسین و کیموتریپسین………………………………………………………………………………………………. 62
4-1-7-1- تایید فرآیند هضم آنزیمی با استفاده از ژلSDS-PAGE
(15درصد) احیایی……………………………………………………………………………………………………… 63
عنوان صفحه
4-1-7-2- مطالعه فعالیت آنتیاکسیدان کازئینهای بتای قندی
و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنها………………………………………………………… 65
4-1-7-3- مطالعه خاصیت مهار آنزیم ACE به وسیلهی کازئینهای
بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آنها………………………… 71
4-1-8- مطالعه آلرژیزایی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای
حاصل از هضم آنزیمی آنها…………………………………………………………………………………………… 73
4-2- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیت آنتیاکسیدانی
و آلرژیزایی کازئینهای شیرگاو…………………………………………………………………………………………. 77
4-2-1- جداسازی و قندی کردن کازئین شیرگاو……………………………………………………….. 77
4-2-2- تایید فرآیند قندی شدن کازئینهای شیرگاو……………………………………………….. 77
4-2-2-1- استفاده از ژل SDS-PAGE (12 درصد) برای تایید
قندی شدن غیرآنزیمی…………………………………………………………………………………………….. 77
4-2-2-2- استفاده از ترکیب OPA برای مطالعهی قندی شدن غیرآنزیمی
کازئینهای شیرگاو……………………………………………………………………………………………………… 78
4-2-3- هضم آنزیمی کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو با آنزیمهای
تریپسین و کیموتریپسین………………………………………………………………………………………………. 80
4-2-4- مطالعه فعالیت آنتیاکسیدان کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو
و پپتیدهای حاصل از هضم آنها………………………………………………………………………………….. 82
4-2-5- مطالعه آلرژیزایی کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو و پپتیدهای
حاصل از هضم آنزیمی آنها به وسیلهی دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین………….. 86
عنوان صفحه
خلاصهی نتایج ………………………………………………………………………………. 90
نتیجهگیری نهایی……………………………………………………………………………………. 91
فهرست منابع و مآخذ 92
شیر
شیر یک مایع زیستی پیچیده متشکل از آب، پروتئین، چربی، کربوهیدرات، مواد معدنی و برخی ترکیبات فعال زیستی از جمله آنزیمها و ویتامینها میباشد که به عنوان اولین ماده غذایی برای نوزاد، بوسیله غدد پستانی موجودات پستاندار ساخته میشود. در اوایل دوران شیردهی، شیر آغوز[1] نامیده میشود که سرشار از آنتیبادیهایی است که خطر ابتلای نوزاد به بسیاری از بیماریها را کاهش میدهد. شیر به عنوان اولین مادهی غذایی برای نوزاد شامل اکثر ترکیبات ضروری و مورد نیاز برای رشد و نمو است. در شکل (1-1) ترکیبات اصلی موجود در شیر مشاهده میشود (Pehrsson، 2000).
شکل1-1- نمایی از ترکیبات موجود در شیر.
شیر نه تنها به عنوان یک مادهی غذای برای تغذیهی نوزاد تازه متولد شده مطرح است بلکه به عنوان یک مادهی غذایی ارزشمند و مغذی برای انسان در تمام کشورهای جهان استفاده می شود. امروزه در سراسر جهان دامداریهای بزرگ در سطح وسیع به تولید شیر و محصولات لبنی مشغولند به طوریکه در سال 2011 میزان تولید شیر در جهان 730 میلیون تن بوده است. هندوستان به عنوان بزرگترین کشور تولید و مصرف کننده شیر در جهان و نیوزلند، 28کشور عضو اتحادیه اروپا، استرالیا و ایالات متحدهی آمریکا به عنوان بزرگترین صادر کننده های شیر و محصولات لبنی میباشند. همچنین چین و روسیه به عنوان بزرگترین واردکنندگان شیر و محصولات لبنی در جهان شناخته میشوند (Blasko، 2011).
1-2- ترکیبات شیر
همانطور که در بالا ذکر شد، شیر یک مادهی غذایی غنی از پروتئین، کربوهیدرات، چربی و ترکیبات معدنی است. درصد، اندازه و نوع هر یک از ترکیبات تشکیل دهنده شیر بسته به گونه جاندار متفاوت است. به عنوان مثال درصد پروتئین شیر انسان نسبت به شیر گاو پایینتراست در صورتی که درصد کربوهیدرات و چربی آن بالاتر میباشد. شیر اسب و الاغ کمترین میزان چربی را در بین گونههای مختلف دارد. همچنین شیر انسان فاقد پروتئین بتالاکتوگلوبولین[2] است، درصورتی که این پروتئین یکی از پروتئینهای اصلی آب پنیر است و به مقدار قابل ملاحظهایی در شیرگاو دیده میشود. در جدول (1-1) درصد ترکیبات موجود در شیر برخی جانوران مشاهده میشود (Nelson و همکاران 1951 ، Barlowska و همکاران 2011).
جدول1-1- ترکیبات سازنده شیر جانوران مختلف بر حسب درصد.
1-3- پروتئینهای شیر
اکثر پروتئینهای شیر در طول زمان شیردهی بوسیلهی سلولهای پوششی غدد پستانی تولید و ترشح میشود. این سلولها علاوه بر پروتئین، ترکیبات دیگری مانند چربی (تریآسیل گلیسرول[3] و دیگلیسرول[4]) و کربوهیدرات (لاکتوز[5]) را نیز تولید و ترشح میکنند (Bouguyo و همکاران 2006، De Kruif و همکاران 2003).
پروتئینهای شیر از نظر ارزش غذایی و فعالیت زیستی بسیار حائز اهمیت هستند و به دو گروه کازئینها (آلفا S1، آلفا S2، بتا و کاپا کازئین) و پروتئینهای آبپنیر (آلفالاکتالبومین[6]، بتا لاکتوگلوبولین، سرم آلبومین[7] و ایمونوگلوبولین[8]) تقسیم میشوند. کازئینهای شیر گاو 80 درصد و پروتئینهای آبپنیر بین20 تا 45درصد کل پروتئینهای شیر انسان را تشکیل
میدهند ( Kunz و همکاران 1990، Wong و همکاران 1996).
شکل1-2- پروتئینهای تشکیل دهنده شیرگاو.
1-3-1- پروتئینهای آبپنیر
پروتئینهای آبپنیر از نوع کروی هستند که حدود 20 درصد پروتئینهای شیر را شامل می شوند. از لحاظ ساختاری این پروتئینها دارای مقدار قابل توجهی مارپیچآلفا[9] در ساختارشان میباشند.
آمینواسیدهای اسیدی، بازی، آبگریز[10] و آبدوست[11] به صورت نسبتا متعادل در طول زنجیره ی پلیپپتیدی این پروتئینها وجود دارد. این پروتئینها در محیط آبی شیر به صورت محلول هستند (Evans، 1982).
پروتئینهای آبپنیر شامل بتالاکتوگلوبولین، آلفالاکتالبومین، ایمونوگلوبولین، آلبومین سرمی، لاکتوفرین[12] و لاکتوپراکسیداز[13] میباشد که غلظت و درصد این پروتئینها در شیر نسبت مستقیم با نوع آبپنیر شامل اسیدی با pH پایین تر از 1/5 و بازی با pH بالاتر یا مساوی 6/5، منبع شیر ( گونهی حیوان)، زمان سال، نوع خوراک حیوان و مرحلهی شیردهی دارد (Pintado 2001).
فعالیتهای زیستی مختلفی به پروتئینهای آبپنیر نسبت داده شده است که از بین این فعالیتها، خواص ضد میکروبی این پروتئینها به میزان زیادی بررسی شده است (Clare وهمکاران 2003).
فرم در حال بارگذاری ...