1-1 تعریف بیماری لیشمانیوز………………………………………………………………… 6
1-1-2 تاریخچه لیشمانیوز در جهان………………………………………………………….. 7
1-1-3 تاریخچه لیشمانیوز در ایران……………………………………………………………. 8
1-2 ردهبندی و طبقهبندی انگل لیشمانیا…………………………………………………… 9
1-3 مورفولوژی و سیر تکاملی انگل لیشمانیا……………………………………………… 11
1-3-1-1 مورفولوژی انگل……………………………………………………………………… 11
1-3-1-2 شکل بی تاژک (آماستیگوت یا جسم لیشمن)…………………………………. 11
1-3-1-3 شکل تاژک دار (پروماستیگوت)…………………………………………………….. 12
1-3-2-1 سیر تکاملی انگل……………………………………………………………………. 15
1-3-2-2 سیر تكاملی انگل در بدن حشره…………………………………………………… 15
1-3-2-3 پشه خاكی……………………………………………………………………………. 15
1-3-2-4 سیر تکاملی انگل در بدن میزبان مهره دار…………………………………………. 16
1-4 راههای انتقال لیشمانیا به انسان……………………………………………………….. 18
1-4-1 انتقال از طریق نیش پشه خاکی………………………………………………………. 19
1-4-2 انتقال مکانیکی…………………………………………………………………………. 19
1-4-3 انتقال از راه خون……………………………………………………………………….. 19
1-4-4 انتقال مستقیم…………………………………………………………………………… 19
1-5 بیماریزایی لیشمانیا…………………………………………………………………………. 20
1-5-1 خصوصیات بیماری لیشمانیا………………………………………………………….. 19
1-5-2 لیشمانیوز احشایی……………………………………………………………………….. 20
1-5-3 لیشمانیوز جلدی پس از کالاآزار (PKDL)…………………………………………….. 21
1-5-3-1 لیشمانیوز جلدی و اشکال بالینی آن………………………………………………… 22
1-5-3-2 لیشمانیوز جلدی خشک…………………………………………………………….. 22
1-5-3-3 لیشمانیوز جلدی مرطوب…………………………………………………………….. 22
1-5-3-4 لیشمانیوز جلدی مزمن (Chronic Cutaneous Leisniasihmas)………………….. 23
1-5-3-4-1 شکل لوپوئید یا عود کننده سالک (Lupoid or Recidivan form)………………. 24
1-5-3-5 لیشمانیوز جلدی- مخاطی……………………………………………………………. 24
1-6 ایمنولوژی عفونتهای لیشمانیا……………………………………………………………… 25
1-6-1 مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز پوستی………………………………………… 25
1-6-1-1 نقش آنتی بادی یا ایمنی همورال…………………………………………………….. 25
1-6-1-2 نقش ایمنی سلولی در لیشمانیوز جلدی…………………………………………… 26
1-6-1-3 عمل سلولهای نوتروفیل و ماكروفاژ در لیشمانیوز………………………………….. 26
1-6-1-3 عملکرد T-CELL……………………………………………………………………….
1-6-2 مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز احشایی………………………………………. 28
1-6-2-1 نقش ایمنی همورال در كالاآزار…………………………………………………………. 28
1-6-2-3 نقش ایمنی سلولی در كالاآزار………………………………………………………… 28
1-6-2-4 .نقش مهم سلول های CD+4……………………………………………………..
1-7 روشهای تشخیص و مطالعه لیشمانیوز…………………………………………………. 30
1-7-1 روشهای مستقیم تشخیص انگل………………………………………………………. 30
1-7-1-1 . جداسازی انگل از کناره ضایعات پوستی یا بافتهای آلوده…………………………. 31
1-7-1-1 رنگ آمیزی……………………………………………………………………………….. 31
1-7-1-2 کشت انگل……………………………………………………………………………….. 32
1-7-2 روشهای ایمنولوژی در شناسایی انگل…………………………………………………. 32
1-7-2-1 آزمایشات سرولوژی برای بررسی ایمنی همورال…………………………………… 32
1-7-2-2 آزمایشات ایمنولوژیکی جهت بررسی ایمنی سلولی……………………………… 33
1-7-2-2-1 تستهای پوستی……………………………………………………………………… 33
1-7-2-3 ماهیت پاسخهای ازدیاد حساسیت تاخیری (DTH)…………………………………… 34
1-7-3 آزمون پوستی لیشمانین یا تست مونتنگرو……………………………………………….. 35
1-7-3-1 معرف آنتیژنی لیشمانین برای تست پوستی………………………………………… 35
1-7-4 تست سنجش تکثیر لنفوسیتی ymphocyte proliferation test(L.T.T) …………….
فصل دوم : مروری بر متون گذشته
فصل سوم: مواد و روشها
3-1کشت انگل………………………………………………………………………………………. 43
3 -1-1 مواد مورد نیاز جهت كشت انگل………………………………………………………….. 43
3-1-2. وسایل مورد نیاز جهت كشت انگل……………………………………………………….. 43
3-1-3. طرز تهیه محیط كشت مایع RPMI- 1640…………………………………………………
3-1-4. طرز تهیه محیط كشت كامل………………………………………………………………….. 44
3-1-5. طرز تهیه محیط كشت NNN……………………………………………………………….
3-1-6. طرز تهیه (PBS) Phosphate Buffered Saline…………………………………………..
3-1-7. روش كشت انگل……………………………………………………………………………. 45
3-1-8. روش شمارش سلولها………………………………………………………………………. 46
3-1-8-1. مواد و وسایل لازم جهت شمارش انگل………………………………………………… 46
3-1-8-2. شمارش با لام نئوبار……………………………………………………………………… 46
3-2. جداسازی انگلها با limiting dilution assay……………………………………………….
3-2-1. مواد و وسایل مورد نیاز برای Limiting dilution assay……………………………….
3-2-2. مراحل Limiting dilution assay…………………………………………………………
3-3. تهیه کرایو برای ذخیره در بانک سلولی…………………………………………………….. 50
3-3-1. مواد و وسایل لازم جهت تهیه کرایو……………………………………………………… 50
3-4 تهیه آنتیژن Freeze – thaw از انگلها جهت درهم ریختگی غشاء و بروز تمامی آنتیژنها…. 52
3-5 الکتروفورز آنتیژنهای پروتئینی در ژل پلیآکریلآمید ( SDS-PAGE )……………………….. 53
3-5-1 اصول الکتروفورز در ژل پلیآکریلآمید……………………………………………………….. 53
3-5-2 سیستم بافری………………………………………………………………………………. 54
3-5-3 مواد و وسایل مورد نیاز برای SDS-PAGE………………………………………………..
3-5-4 آمادهسازی نمونه………………………………………………………………………….. 57
3-5-6 طرز تهیه بافر الکترود…………………………………………………………………………. 57
3-5-7. روش انجام SDS-PAGE…………………………………………………………………….
3-5-8 روش رنگآمیزی با کوماسی آبی R- 250…………………………………………………
مواد مورد نیاز رنگآمیزی کوماسی آبی R- 250:………………………………………………..
3-6 سنجش میزان پروتئین تام با Bradford assay…………………………………………..
3-6-1 مواد و معرفهای مورد نیاز تست Bradford……………………………………………..
3-6- 2 روش کار سنجش پروتئین تام……………………………………………………………. 61
3-7 تست Lymphocyte transformation test (L.T.T)………………………………………..
3-7-1 روش انجام تست L.T.T………………………………………………………………….
1-3-7-1. مواد و وسایل لازم جهت انجام تست L.T.T………………………………………..
3-8 ایمنیزایی در خوکچه هندی…………………………………………………………………. 66
3-8-1 مواد و وسایل مورد نیاز ایمنیزایی در خوکچه هندی…………………………………….. 67
3-8-2 نحوه ایمنیزایی در خوکچه………………………………………………………………… 67
3-9 تزریق داخل پوستی آنتیژنها و سنجش میزانDTH…………………………………..
3-9-1 مواد و وسایل لازم برای تزریق داخل پوستی و سنجش میزان DTH…………….
3-9-2 مراحل تزریق داخل پوستی………………………………………………………………. 69
3-9-3 نحوه سنجش میزان DTH………………………………………………………….
فصل چهارم: نتایج
4-1 کشت اولیه و جداسازی تک کلونها با روش limiting dilution………………………
4-2 بررسی پروفایل پروتئینی در آنالیز تک کلونها…………………………………………… 72
4-3 نتایج میزان پروتئین تام آنتیژنها به روش Bradford………………………………..
4-4 بررسی نتایج تست L.T.T………………………………………………………………
4-4-1 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتیژن B…………………………………………….
4-4-2 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتیژن C…………………………………………….
4-4-3. نتایج تست L.T.T در نمونه آنتیژن D…………………………………………….
4-4-4 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتیژن لیشمانین استاندارد (M)……………………… 76
4-4-5. بررسی نتایج حاصل از اندکس تحریکی تمامی آنتیژنها و میانگین آنها در مقایسه با Con-A
4-4-6 بررسی نتایج کلی L.T.T…………………………………………………………….
4-5 بررسی نتایج تستهای DTH بر روی خوکچههای هندی………………………………. 79
4-5-1 نتایج تست DTH 24 ساعته………………………………………………………… 79
4-5-2 نتایج تست DTH 48 ساعته……………………………………………………………. 82
4-5-3 نتایج تست DTH 72 ساعته………………………………………………………… 83
فصل پنجم: بحث و پیشنهادات
منابع……………………………………………………………………………………………… 95
خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………….. 106
خلاصه فارسی:
لیشمانیا ماژور یک انگل پاتوژن پروتوزوأ داخل سلولی است که عامل طیف وسیعی از عفونتهای پوستی با پیامدهای بالینی متنوع، از یک زخم پوستی خود بهبود شونده تا زخمهای گسترش یافته غیر بهبود شونده میباشد. ایمنی سلولی نقش مهمی در مقاومت در برابر لیشمانیا ماژور بازی میکند. واکنشهای حساسیت شدید دیررس که با تستهای پوستی لیشمانین تشخیص داده میشوند یک روش تشخیصی برای سنجش ایمنی سلولی است و بطور وسیع برای سنجش اپیدمیولوژیکی افراد در معرض آنتیژنهای لیشمانیایی، سنجش واکسنهای کاندید و در کمک به تشخیص، مورد استفاده است. تست پوستی لیشمانین پبطور عمومی به نام تست مونتنگرو یا تست لیشمانین شناخته میشود، که نیازمند یک آنتیژن استاندارد خالص و هموژن میباشد.
هدف: تهیه و سنجش تککلونهای جداشده از لیشمانیا ماژور برای تست پوستی
روش: جداسازی تککلونها از سوش لیشمانیا ماژور مرجع (MRHO/IR/75/ER) به روش رقت دهی محدود شونده انجام گرفت. کلونهای جداشده با استفاده از روشهای برونتنی، SDS-PAGE و تست تکثیر لنفوسیتی با استفاده از سلولهای تکهستهای خون محیطی افراد بهبود یافته از عفونت لیشمانیا ماژور مورد ارزیابی قرار گرفتند. توانایی هر تککلون جداشده با تست پوستی چهار خوکچه هندی ایمن شده دربرابر لیشمانیا ماژور مورد سنجش قرار گرفته شدند. تک کلون های جداشده بههمراه لیشمانین در ناحیه اصلاح شده شکمی حیوانها بطور داخل پوستی تزریق شدند.
نتایج: نتایج نشان دادند که سه نمونه از هفت تککلون ( نمونه D و(B,C در آنالیزهای SDS-PAGE یک تک باند را نشان دادند. این تککلونها برای سنجش در تست تکثیر لنفوسیتی مورد استفاده قرار گرفتند که همگی میزان ضریب تحریک (03/2±71/8، 65/2±71/8، 13/2±43/8 به ترتیب) قابل مقایسهای با لیشمانین ( 512/3±10) نشان دادند. سنجش درونتنی تککلونهای جداشده، در خوکچههای هندی نشان داد که هر سه تککلون میزان القاء قابل قبولی در مقایسه با لیشمانین از خود نشان دادند. بعلاوه، کلون C (83/0±333/7) میزان القاء معنادار بیشتری از لیشمانین ( mm00/4) در خوکچههای هندی تست شده با آنتیژن C نشان داد.
یافته ها: اطلاعات نشان دادند که تک کلونهای جداشده توانایی القاء واکنشهای درونتنی و برونتنی قابل مقایسهای با لیشمانین استاندارد دارند و امکان استفاده جهت آنتیژن خالص و هموژن را در تستهای پوستی در مطالعات لیشمانیوزی را دارند
انگل لیشمانیا یک پروتوزوای جنس لیشمانیا یک پاتوژن داخل سلولی است که می تواند باعث ایجاد طیف وسیعی از بیماری های انسانی از یک زخم پوستی ساده تا عفونت های احشایی شود که با گزش پشه خاکی آلوده به میزبان پستاندار از جمله انسان منتقل میشود(99).
به بیماریهای حاصل از انگل های جنس لیشمانیا، لیشمانیازیس گفته میشود. این بیماری در 88 کشور در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری جهان گسترش یافته است و اینک 12 میلیون نفر به این انگل مبتلا می باشند و350 میلیون نفر در خطر ابتلا به این بیماری قرار دارند. با وجود کوشش هایی که برای مبارزه با بیماری انجام شده، سالیانه 1 تا 2 میلیون مورد جدید جهانی گزارش می شود ، که 5/1 میلیون مورد از نوع جلدی و500هزار نفر از انواع احشایی میباشد. در انسان بیماری به سه فرم بالینی جلدی (CL)[1]، جلدی مخاطی (ML)[2] و احشایی (VL)[3] بروز میکند(57،83).
عفونتهای پارازیتی مثل لیشمانیوز می توانند در بیماریهای ایمنوساپرس کننده مثلHIV پدیدار شود. عفونت توأم این بیماریها با لیشمانیوز بعنوان یک تهدید جدی در کشورهایی است که هر دو عامل پاتوژنیک را دارند( 106).
سازمان بهداشت جهانی آن را در زمره 8 بیماری مهم انگلی دنیا با شیوع بالا در جهان قرار داده است. کنترل این بیماری از اولویتهای سیستم بهداشتی و درمانی جهان است و نیز از اولویتهای تحقیقاتی انیستیتو پاستور ایران نیز میباشد(49).
افراد در تمام سنین در معرض ابتلا به این بیماری می باشند. بیش از %90 موارد ابتلا به لیشمانیای پوستی در کشورهای افغانستان، عراق، پرو، عربستان سعودی و متأسفانه ایران گزارش شده است( 47). این انگل امروزه بصورت انگلی فرصت طلب در افراد دچار نقص ایمنی درآمده است و به دلیل اینکه در ایران نیز موارد ابتلا به آن زیاد می باشد، لذا لازم است در زمینه شناخت بیشتر خود انگل و راههای مقابله با آن مطالعات وسیعتری صورت گیرد.
فصل اول: کلیات
تعریف بیماری لیشمانیوز:
انگل پروتوزوای جنس لیشمانیا یک پاتوژن داخل سلولی است که می تواند باعث بروز طیف وسیعی از بیماری های انسانی از یک زخم پوستی تا عفونت های احشایی شود. این انگلها با گزش پشه خاکی آلوده به میزبان پستاندار از جمله انسان منتقل میشود( 47). این بیماری در نواحی روستایی و شهری بیشتر نقاط کشور وجود دارد. ناقل بیماری تنها یک سوم اندازه پشه معمولی است و به سختی با چشم دیده می شود. انسان در نوع شهری لیشمانیوز (سالک شهری) به عنوان میزبان اصلی محسوب می شود و به ندرت اتفاق می افتد که از مادر باردار به جنین یا با انتقال خون یا سوزن آلوده سرایت کند( 47).
این بیماری در انسان می تواند به اشکال مختلف بروز نماید و در مورد فرم احشایی در صورت عدم درمان حتی به مرگ منجر گردد(29،17). ژنوم این انگل در سال 2002 حدود 32 مگا باز ژنوم و8500 ژن تخمین زده شد که با ترجمه آنها بیشتر از 10000 پروتئین حاصل خواهد شد(16).
یکی از خصوصیات مهم انگل لیشمانیا، رشد و تکثیرآن در درون فاگولیزوزومهای ماکروفاژها است. تعداد کمی از میکروارگانسیم ها قادرند که تحت چنین شرایطی ودر مجاورت انواع آنزیم های هیدرولیتیک زندگی کنند. بنابراین مراحلی که منجر به ورود انگل به درون فاگولیزوزوم میگردد از اهمیت خاصی برخوردار است(77).
میزبان مهره دار برای انگل شامل میزبان پستاندار وخزنده است که میزبان پستاندار شامل انسان، سگ، سگ سانان و برخی جوندگان ودیگر جانوران وحشی می باشد. لیشمانیوزها عموما توسط گونه های پشه خاکی منتقل می شوند. ناقل این انگل ها در دنیای قدیم (همه قاره ها بجز آمریکا) پشه خاکی های متعلق به جنس فلوبوتوموس می باشد و در دنیای جدید گونه های مختلف پشه خاکی های ماده از جنس لوتزومیا
میباشد(20،92،69،101).
عامل بیماریزایی در لیشمانیوز، یعنی لیشمانیا، از راسته کینتوپلاست داران است که برحسب سیر تکاملی و محیط زیست خود به دو شکل بی تاژک یا آماستیگوت (یا جسم لیشمن) در درون سلولهای سیستم رتیکولواندوتلیال مهره داران مانند ماکروفاژها و شکل تاژکدار پروماستیگوت (یا لیپومونادی) در درون بدن پشه خاکی ناقل و محیط کشتهای مصنوعی مثل NNN[1] دیده میشود (3).
2-1-1- تاریخچه لیشمانیوز در جهان
کانینگهام[1] در سال 1885 در فرانسه ترشحات زخم پوستی بیماری را که به آن تاول دهلی می گفتند، مورد مطالعه قرار دارد. این محقق، ماکروفاژهای میزبان را انگل آمیبی پنداشته و اجسام داخل ماکروفاژها را هاگ (اسپور) تصور کرده بود(64). رایت اجسامی شبیه به آنچه کانینگهام گزارش داده بود در زخم پوستی دختری که از ارمنستان به بوستون مهاجرت کرده بود مشاهده کرد. او این انگل را هلیکوزوماتروپیکوم نامید و فکر می کرد که متعلق به گروه میکروسپوریدیا باشد(3و18). در سال 1900 لیشمان[2] در طحال سربازی که از تب دام دام[3] در هندوستان مرده بود اجسام بیضی شکلی را در داخل سلول های بزرگی مشاهده کرد (دام دام شهری است که بیماری لیشمانیوزاحشائی در آن دیده شده بود). لیشمان نتیجه مطالعات خود را در سال1903 منتشر ساخت.
در همین سال دونووان[4] در مدرسه هندوستان اجسامی شبیه به آن چه لیشمان در بیماری دام دام یافته بود در طحال بیمارانی که مبتلا به تب های نامرتب میشدند مشاهده کرد. امروزه به تب دام و سایر بیماری های شبیه به آن لیشمانیوز احشایی یا کالاآزار گفته میشود. راس نیز در سال 1903 جنس لیشمانیا را معرفی کرد. لاوران ومسنیل در همان سال نام لیشمانیا دونووانی را به عنوان عامل بیماری کالا آزارپیشنهاد کردند. سپس تشابه شکل انگل زخم شرقی وعامل کالاآزار تایید گردید و لوهه در سال 1906 نام لیشمانیا تروپیکا را برای عامل زخم شرقی و یا سالک پیشنهاد کرد(53،95). ونیون در سال 1911 خاطر نشان ساخت که فلبوتوم ممکن است ناقل بیماری های ناشی از لیشمانیا باشد. ولی 30 سال گذشت تا نظریه ونیون توسط آدلر به اثبات رسید. این محققین نشان دادند که فلبوتوموس پاپاتاسی در حقیقت ناقل لیشمانیا تروپیکا به انسان است وسوامینات و همکاران ملاحظه کردند که فلبوتوموس آرجنتیپس ناقل لیشمانیا دونووانی است(86،87،93).
3-1-1- تاریخچه لیشمانیوز در ایران
در کتاب قانون ابوعلی سینا در مورد زخمی به نام جیرونیه یا خیرونیه که درمان مشکلی دارد و در برابر داروهای گوناگون مقاومت می کند بحث شده است. در شرح اسباب ملانفیس از بیماری ای به نام شلیم نام برده شده که تظاهرات آن با زخم سالک مشابه است (3).
در اوایل قرن بیستم مطالعات کاملی درباره لیشمانیوز پوستی در تهران توسط دکتر پولاک که یکی از اساتید پزشکی مدرسه دارالفنون بود، انجام گرفت. وی شرح جامعی درباره بیماری سالک نوشت.
در سال 1916 گاشه از دیگر اساتید پزشکی دارالفنون 21 سگ را در تهران مورد مطالعه قرار داد که 15 سگ به سالک مبتلا بودند.
از سال 1320 به بعد محققان ایرانی نظیر دکتر انصاری، دکتر مفید و دکتر ندیم در مورد اپیدمیولوژی، خصوصیات آزمایشگاهی انگل، گونه های پشه خاکی مناطق آلوده و درمان انواع سالک در نقاط مختلف ایران مطالعات و آزمایشاتی را انجام دادند(9). در 1328 برای نخستین بار دکتر پویا در مقاله ای سه مورد بیماری را که از لحاظ بالینی و آزمایشگاهی تشخیص آنها قطعی بود معرفی کرد و وجود کالاآزار در ایران را اعلام نمود.
از سال 1328 تا 1340تعداد 24 مورد کالاآزار از نقاط مختلف کشور نظیر تهران، تنکابن، آبادان، شیراز و نیشابور گزارش شد. از 1340 به بعد موارد بیشتری از بیماری بخصوص در استان فارس و بین عشایر بصورت تک گیر مشاهده شد. در فاصله سالهای 1353 تا 1358 فقط در بیمارستانهای وابسته به دانشگاه شیراز 131 مورد کالاآزار گزارش شد که اکثر بیماران اطفال زیر 7 سال بودند(2.3).
مطالعاتی که در سالهای 1364 تا 1368 در مشکین شهر استان اردبیل انجام گرفت نشان داد که بیماری در این مناطق از سالها قبل به صورت اندمیک (بومی) وجود داشته است و ممکن است در سالهای اخیر به صورت اپیدمی بروز کرده است. زیرا در این مدت بیش از 600 مورد کالاآزار از استان اردبیل تشخیص داده شد که 520 مورد آن در شهرستان مشکین شهر بوده است(2،6).
[1]- Cuningham
[2] -leishman
[3] -Dum Dum fever
[4] -Charls Donovan
[1]- Novy- McNeal- Nicolle
[1] -Cutaneous Leishmaniasis
[2]-mocusal leishmanianiasis
[3] -visceral leishmaniasis
فرم در حال بارگذاری ...