وبلاگ

جدول 3-1       روش تهیه استاندارد لوله های مک فارلند. 55

 

 

جدول 4-1       نتایج آزمایش MIC و MBC نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد. 67

 

 

بر میلی لیتر μg⁄ml 68

 

 

جدول 4-3       قطر هاله عدم رشد سویه های میکروبی مورد آزمایش در برابر تعدادی از دیسک های آنتی بیوتیکی متداول در آزمایش دیسک دیفیوژن 77

 

 

فهرست نمودارها

 

 

نمودار 4-1       نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پنومونیه. 71

 

 

نمودار 4-2       نمودار حداقل غلظت کشندگی ( MBC ) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پنومونیه. 71

 

 

نمودار 4-3       نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پیوژن. 72

 

 

نمودار 4-4       نمودارحداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پیوژن. 72

 

 

نمودار 4-5       نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استافیلوکوک اورئوس… 73

 

 

نمودار 4-6       نمودارحداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استافیلوکوک اورئوس… 73

 

 

نمودار 4-7       نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر پسودوموناس آئروژینوزا 74

 

 

نمودار 4-8       نمودارحداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر پسودوموناس آئروژینوزا 74

 

 

فهرست شکل ها

 

 

شکل 1-1         سینوس های پارانازال اطراف بینی و صورت… 3

 

 

شکل 1-2         استرپتوکوک پیوژن رشد یافته در کشت خون. 11

 

 

شکل 1-3         رنگ آمیزی گرم از خلط که در آن استرپتوکوک پنومونیه. 13

 

 

شکل 1-4         رنگ آمیزی گرم استافیلوکوک اورئوس… 17

 

 

شکل 1-5         رنگ آمیزی گرم پسودوموناس آئروژینوزا 20

 

 

شکل 1-6         گیاه درمنه. 24

 

 

شکل 1-7         گیاه اسطوخودوس… 25

 

 

شکل 1-8         گیاه دارچین.. 28

 

 

شکل 1-9         چوب و پودر دارچین.. 28

 

 

شکل 1-10       گیاه مورد. 31

 

 

شکل 1-11       ساختار شیمیایی پلیمر کیتوزان. 34

 

 

شکل 1-12       ساختار مولکولی کیتین.. 35

 

 

شکل 3-1         اسانس های تهیه شده از شرکت باریج اسانس کاشان. 51

 

 

شکل 3-2         دستگاه اولترا سونی کیت در مرکز ژنتیک… 52

 

 

شکل 4-1         نتایج طیف سنجی مادون قرمز حاصل از ترکیب بیوپلی ساکاریدی کیتوزان. 62

 

 

شکل 4-2         نتایج طیف سنجی مادون قرمز حاصل از ترکیب اسید میرستیک… 62

 

 

شکل 4-3         نتایج حاصل از طیف سنجی مادون قرمز دو ترکیب کیتوزان و اسید میرستیک در کنار هم. 63

 

 

شکل 4-4         توزیع اندازه نانوذرات ترکیبات اسانس نانوکپسول شده با استفاده از دستگاه DLS. 64

 

 

شکل 4-5         تصویر ساختار نانوکپسول های کیتوزان حاوی اسانس توسط میکروسکوپ الکترونی.. 65

 

 

شکل 4-6         تصویر ساختار نانوکپسول کیتوزان حاوی اسانس توسط میکروسکوپ الکترونی.. 65

 

 

شکل 4-7         میکروپلیت بعد از انجام آزمایش MIC.. 66

 

 

شکل 4-8         میکروپلیت بعد از انجام آزمایش MIC.. 67

 

 

شکل 4-9         پلیت کشت داده شده مربوط به تأثیر نانواسانس اسطوخودوس بر روی استرپتوکوک پیوژن بعد از آزمایش MIC بر روی

 محیط کشت بلاد آگار برای تعیین MBC.. 69

 

 

شکل 4-10       پلیت کشت داده شده مربوط به تأثیر نانواسانس دارچین بر روی استرپتوکوک پنومونیه بعد از آزمایش MIC بر روی محیط کشت بلاد آگار برای تعیین MBC.. 69

 

 

شکل 4-11       پلیت های کشت شده مربوط به تأثیر اسانس اسطوخودوس بر روی استافیلوکوک اورئوس بر روی محیط آگار برای تعیین MBC.. 70

 

 

شکل 4-12       پلیت های کشت داده شده مربوط به تأثیر اسانس مورد بر روی پسودوموناس آئروژینوزا بر روی محیط آگار برای تعیین MBC، رقت شماره 3 رقت MIC.. 70

 

 

شکل 4-13       پلیت های تلقیح شده با باکتری پسودوموناس آئروژینوزا حاوی دیسک های کاغذی آغشته به غلظت های مختلف نانواسانس اسطوخودوس… 76

 

 

شکل 4-14       پلیت های تلقیح شده با باکتری استافیلوکوک اورئوس حاوی دیسک های کاغذی آغشته با غلظت های مختلف نانواسانس دارچین.. 76

 

 

شکل 4-15       پلیت تلقیح شده با باکتری استافیلوکوک اورئوس حاوی دیسک های آنتی بیوتیکی.. 77

 

 

شکل 4-16       پلیت تلقیح شده با پسودوموناس آئروژینوزا حاوی دیسک های آنتی بیوتیکی.. 78

 

 

شکل 4-17       پلیت تلقیح شده با باکتری استرپتوکوک پیوژن حاوی دیسک های آنتی بیوتیکی.. 78

 

 

شکل 4-18       پلیت تلقیح شده با استافیلوکوک اورئوس. قطر هاله عدم رشد در اطراف چاهک ها به خوبی قابل مشاهده است   79

 

 

شکل 4-19       پلیت تلقیح شده با پسودوموناس آئروژینوزا. قطر هاله عدم رشد در اطراف چاهک ها به خوبی قابل مشاهده است   80

 

 

شکل 4-20       پلیت تلقیح شده با پسودوموناس آئروژینوزا با غلظت های مختلفی از نانواسانس درمنه. 80

 

 

شکل 4-21       پلیت تلقیح شده با استافیلوکوک اورئوس با غلظت های مختلفی از نانواسانس مورد. 80

 

 

خلاصه فارسی

 

 

سینوزیت یکی از شایع ترین موارد در بین مراجعان به پزشک عمومی است که احتیاج به تجویز آنتی بیوتیک دارد. از جمله باکتری های شایع در ایجاد این بیماری می توان به استرپتوکوک پنومونیه، استرپتوکوک پیوژن، استافیلوکوک اورئوس و پسودوموناس آئروژینوزا اشاره کرد. امروزه با توجه به اثرات مضر داروهای شیمیایی بر بدن انسان، استفاده از روش های نوین فرمولاسیون مانند نانوکپسول کردن اسانس های گیاهی به دلیل کارایی بیشتر و همچنین کاهش عوارض سوء ناشی از کاربرد مستقیم آن ها مورد توجه قرار گرفته است. در این مطالعه که به روش in vitro می باشد، اثر ضدمیکروبی چهار نوع نانواسانس گیاهی بر روی میکروارگانیسم های استرپتوکوک پنومونیه، استرپتوکوک پیوژن، استافیلوکوک اورئوس و پسودوموناس آئروژینوزا که از عوامل مهم سینوزیت می باشد در مقایسه با اسانس های طبیعی آن ها بررسی گردید، ابتدا تست کمی حداقل غلظت مهار کننده رشد (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC) و سپس تست کیفی (دیسک دیفیوژن) انجام گرفت. نتایج تست کمی MIC از نانواسانس های مورد بررسی در مورد استرپتوکوک پنومونیه با نانواسانس اسطوخودوس 097/0، استرپتوکوک پیوژن با نانواسانس درمنه و اسطوخودوس  097/0، استافیلوکوک اورئوس با نانواسانس درمنه  562/1 و در پسودوموناس آئروژینوزا با نانواسانس درمنه و اسطوخودوس  125/3 بدست آمد و نتایج بدست آمده در مقایسه با اسانس های طبیعی، تأثیر کمتر نانواسانس ها را نشان داد. و در تست دیسک دیفیوژن معلوم شد که نانواسانس ها قدرت رهایش از دیسک های کاغذی و انتشار در محیط جامد را ندارد.

 

 

نتایج، بیانگر اثرات خوب نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین بر روی چهار میکروارگانیسم های عامل سینوزیت می باشد و می توانیم به ساخت داروهای مناسب برای از بین بردن این میکروارگانیسم ها با منشأ گیاهی و با عوارض بسیار کمتر دارویی امیدوار باشیم.

 

 

واژه های کلیدی: نانواسانس، اسطوخودوس، درمنه، مورد، دارچین، MIC، MBC

 

 

فصل اول

 

 

کلیات

 

 

1-1 سینوزیت

 

 

سینوزیت عبارت است از یک تغییر التهابی در مخاط سینوس های پارانازال که علت آن می تواند آلرژی، ویروس، باکتری و ندرتا قارچ باشد]4[.

 

 

سینوس های پارانازال، حفرات هوایی اطراف بینی هستند که توسط مخاط بینی پوشیده شده و از منافذی به فضای داخلی بینی راه می یابد و شامل فرونتال، اتموئید، ماگزیلاری و اسفنوئید می باشد(شکل 1-1)]28[.

 

 

شکل 1-1 سینوس های پارانازال اطراف بینی و صورت

 

 

سینوزیت شایع ترین بیماری درگیر کننده سینوس ها بوده و از نظر بالینی به سه نوع حاد ( دوره بیماری کمتر از سه هفته )، تحت حاد ( تداوم بیماری به مدت سه هفته تا سه ماه ) و مزمن (دوره بیماری بیش از سه ماه ) تقسیم می گردد]28[. سینوزیت در بیماری های سیانوتیک قلب، کاهش ایمونوگلوبولین ها، ایدز، لوله گذاری تراشه، سندروم مژه بی حرکت و عفونت های دندانی شیوع بیشتری دارد]4[.

 

 

 

سلول‌های فیبروبلاست در محیط کشت DMEM حاوی غلظت‌های ۵%، ۸%، ۱۰%، ۱۵% و ۲۰% از عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف همراه با گروه کنترل مثبت که حاوی FBS 10% و کنترل منفی که خالی از هر ۲ (FBS و UCB-PL) بود، کشت شدند و همچنین از گروه (UCB-PL/FBS) که به نسبت مساوی از عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف و FBS استفاده شد. تعیین مقدار مناسب و مؤثر بر تکثیر و درصد بقاء سلولی توسط شمارش سلولی با تریپان‌بلو در زمان‌های متفاوت ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت بررسی شد. هم‌چنین برای تعیین مقدار مناسب برای مهاجرت سلولی از تکنیک Scarch assay استفاده شد. سپس اثر عصاره پلاکتی با غلظت‌های متفاوت بر بیان ژن‌های smad2-smad3 در سلول‌های فیبروبلاست توسط تست Real Time -PCR موردبررسی قرار گرفت. در مرحله آخر جهت بررسی اثر عصارهی پلاکتی بر مسیر سیگنالینگ Smad، مقدار بیان پروتئین‌های  Smad2-Smad3-Psmad2-Psmad3توسط تکنیک وسترن بلات ارزیابی شد.

 

 

نتایج:

 

 

در بررسی تکثیر و درصد بقاء و مهاجرت سلول‌های فیبروبلاست در اثر تیمار با عصاره پلاکتی بالاترین غلظت مؤثر مربوط به دز ۱۰% نشان داده شد و نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که افزایش غلظت عصاره پلاکتی، اثر افزایشی بر تکثیر و درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست

 ندارد. همچنین عصاره پلاکتی در دز ۱۰% سبب افزایش سرعت مهاجرت سلول‌های فیبروبلاست می‌شود. در نتایج حاصل از تکنیک Real time اثر عصاره پلاکتی در غلظت ۱۰% با افزایش بیان ژن‌های

Smad2-Smad3 نسبت به گروه‌های کنترل منفی و مثبت با تفاوت معناداری نشان داده شد. در بررسی‌های صورت گرفته در سنجش اثر عصاره پلاکتی در غلظت‌های مختلف ۸%، ۱۰% و گروه UCB-PL/FBS و گروه کنترل مثبت و منفی بر بیان پروتئین‌های Smad2-Smad3-Psmad2-Psmad3 به‌واسطه تکنیک وسترن بلات نشان داد که تمامی گروه‌ها تفاوت معناداری نسبت به گروه کنترل منفی دارند. پروتئین‌های Psmad2-Psmad3 که پروتئین‌های فرم فعال‌شده Smad2-Smad3 هستند تنها در گروه کنترل منفی دیده نشدند بلکه در تمامی گروه‌هایی که داری عصاره پلاکتی بودند این پروتئین‌ها فعال شدند.

 

 

نتیجه‌گیری

 

 

یکی از مهم‌ترین سلول‌های دخیل در امر ترمیم زخم، فیبروبلاست­ها می‌باشند، که با تکثیر و مهاجرت سلولی و به راه انداختن مسیرهای سیگنالینگ درون‌سلولی مربوط به ترمیم زخم در پیشبرد فرایند ترمیم نقش کلیدی بر عهده‌دارند. در این مطالعه با نشان دادن اثر عصاره پلاکتی بر اعمال مهم و ضروری سلول‌های فیبروبلاست در فرایند ترمیم زخم می‌توان نتیجه گرفت که فرآورده عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف می‌تواند نقش بسزایی در افزایش ترمیم زخم‌ها داشته باشد.

گستردگی‌و تنوع‌ کاربردهای‌ بیوتکنولوژی‌، تعریف‌ و توصیف‌ آنرا کمی‌ مشکل‌ و نیز متنوع ‌ساخته‌ است‌. برخی‌ آنرا مترادف‌ میکروبیولوژی‌ صنعتی‌ و استفاده‌ از میکروارگانیسم‌ها و برخی‌ آنرا معادل‌ مهندسی‌ ژنتیک‌ تعریف‌ می‌کنند. در صنعت نیز آدمی با استفاده از علم بیوتکنولوژی و نقش ارگانیسم‌ها به عنوان کاتالیست از میکروارگانیسم‌ها استفاده کرده است. در واقع میکروبیولوژی صنعتی، واژه‌ای قدیمی است که در مورد استفاده میکروارگانیسم‌ها در صنعت بیان شده است و امروزه آن را به تکنولوژی میکروبی [1]تغییر داده‌اند.

 

 

امروزه با مطالعات فراوانی که دانشمندان در عرصه‌های مختلف انجام داد‌ه‎اند، می‌توان بی‌اغراق ادعا کرد که استفاده از میکروارگانیسم‎ها انقلاب عظیمی در همه ابعاد زندگی انسان به وجود آورده‌است. بشر با شناخت میکروارگانیسم‌ها از گذشته تا کنون هم توانسته فعالیت های نامناسب آنها را بر زندگی انسان کنترل کند در واقع از آنها بر علیه خودشان استفاده کند و هم از آنها در زمینه‎های گوناگون بهره ببرد.

 

 

در حال حاضر شاهد کاربرد میکروارگانیسم‌ها در تولید انواع محصولات دارویی از جمله آنتی‌بیوتیک‌ها هستیم. از دیگر مواد حاصل از متابولیت آنها برای مصارف پزشکی و افزودنی‌های غذایی نظیر الکل‌ها، ویتامین‌ها، آنزیم‌ها و … بهره می‌بریم. همچنین در صنعت شاهد نقش موثر این موجودات ریز در زمینه‌های مختلف هستیم.

 

 

به طور کلی می‌توانیم بگوییم که فواید این موجودات ریز بیش‌تر از مضرات آن‌ها است و به همین سبب این موجودات نقش بسیار مهمی در صنعت برای تولید صنایع گوناگون، در تهیه‎ی مواد‌غذایی مثل ماست، پنیرهای قارچی و خیارشور و …، در تولید فرآورده‌های دارویی از جمله آنتی‌بیوتیک‌ها را ایفا می‌کنند. در واقع تولید فرآورده‌های دارویی مهم‌ترین فایده‌ی آن‌ها است زیرا با این کار در واقع جان بسیاری از انسان‌ها را در عصرهای گوناگون نجات می‌دهند و این شاید مهم‌ترین و ارزنده‌ترین فعالیتی باشد که هر موجود جاندار چه کوچک و چه بزرگ در روی این زمین خاکی بتواند انجام دهد.

 

 

 

میکروب‌شناسی صنعتی به بررسی این میکروارگانیسم‌ها پرداخته و سعی در شناسایی انواع جدید و تولید موتانتهای میکروبی با کارایی و میزان محصول بیشتر و هزینه کمتر دارد.

 

 

میکروب‌شناسی صنعتی امروزه وسیعترین زمینه پژوهشهای میکروب‌شناختی را تشکیل می‌دهد و بیشترین هزینه و امکانات را در زیست‌شناسی به خود اختصاص داده است.

 

 

ﺑﺮ اﺳﺎس آﻣﺎر‌ﻧﺎﻣﻪ داروﻳﻲ ﻛﻪ ﻫﺮ ﺳﺎﻟﻪ ﺗﻮﺳﻂ وزارت ﺑﻬﺪاﺷﺖ ﺗﻬﻴﻪ ﻣﻲ‌ﮔﺮدد، ﺑﻴﺸﺘﺮﻳﻦ ﻣﺼﺮف دارو دراﻳﺮان ﻣﺮﺑﻮط ﺑﻪداروﻫﺎی آﻧﺘﻲ‌ﺑﻴﻮﺗﻴﻚ ﻣﻲ‌ﺑﺎﺷﺪ. اریترومایسین ، یکی از انواع ﭘﺮﻣﺼﺮف آنتی‌بیوتیک‌ها است. در ﺳﺎﻟﻬﺎی اﺧﻴﺮ ﺗﻼﺷﻬﺎی ﺑﺴﻴﺎری در ﺟﻬﺖ ﺧﻮدﻛﻔﺎﻳﻲ و ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮر ﺑﺮﻃﺮف ﻛﺮدن واﺑﺴﺘﮕﻲ ﻛﺸﻮر در زﻣﻴﻨﻪ‌ﻫﺎی ﻣﺨﺘﻠﻒ ﺻﻨﻌﺘﻲ اﻧﺠﺎم ﺷﺪه ﻛﻪ در اﻳﻦ ﻣﻴﺎن ﺻﻨﺎﻳﻊ داروﻳﻲ از اﻫﻤﻴﺖ وﻳﮋه ای ﺑﺮﺧﻮردار اﺳﺖ. ﺑﻪ دﻟﻴﻞ رﺷﺪ ﻓﺰاﻳﻨﺪه ﺟﻤﻌﻴﺖ و ﻧﻴﺎز ﻛﺸﻮر ﺑﻪ دارو، ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮر ﺳﻬﻮﻟﺖ ﺗﻬﻴﻪ دارو ﺑﺎ ﻫﺰﻳﻨﻪ ﻛﻤﺘﺮ ﺑﺮای ﺑﻴﻤﺎران، پژوهش‌های زیادی صورت گرفته است.

 

 

علم بیوتکنولوژی در رشته‌های مختلف علمی باعث ایجاد نوآوری و پیشرفت‌های چشم‌گیر شده است. تلاش و کوشش ما بر این بوده است که کاربرد این علم را در فرآیندهای تولید آنتی‌بیوتیک مورد بررسی قرار دهیم.

یک گلیکوپروتئین  گذرنده از غشا از  خانواده(ALCAM )مولکول چسبنده لکوسیت فعال شده

 

 

ایمنوگلوبولین[1] هاست که دارای یک دومین خارج سلولی با 500 امینو اسید ، یک دومین گذرنده از غشا به طول 22 امینو اسید و هم چنین یک دومین کوتاه سیتوپلاسمی به طول 34 امینو اسید می باشد.(اولریچ وایدله و همکاران[2]،2010؛  مایکل بوون و همکاران[3] ،2010 ؛توماس برورنر و         )و از 163q13.1q13.2همکاران[4]،2012) ژن انسانی این پروتئین بروی کروزوم 3 قرار دارد(

 

 

200 تشکیل شده است همچنین وزن موکلولی ان 105 کیلو Kb اگزون[5] و اندازه ایی بیش از

 

 

دالتون می باشد(اولریچ وایدله و همکاران ،2010) این پروتئین شامل پنج دومین خارج سلولی  می باشد .(سالمون اوفوری و جودی کینگ[6]،2008C2[7]و سه نوع V[8] ایمنو گلوبولین دو نوع

 

 

مابکل بوون واروفوو[9]،1999)

 

 

گیادو اسوارت[10]،2002))ALCAM شکل1- 1  نمای شماتیک از ساختار پروتئین

 

 

این پروتئین در تعامل سلول- سلول از نوع هموفیلیک و هتروفیلیک نقش دارد.در نوع هموفیلیک    واکنش می دهد.(اولریچ  CD6) و در تعامل هتروفیلیک با ALCAM-ALCAM با خودش (

 

 

وایدله و همکاران،2010؛ اریک اندرسون و همکاران[11]،2011؛کاترینا فانالی و همکاران[12] ،2014) این پروتئین هم چنین در مهاجرت سلولی  نقش ایفا می کند.(جودی کینگک و همکاران [13]،2004 )

 

 

 

به طول110 امینواسیدV2  به طول 93 امینو اسید  و هم چنین V1شامل دو قسمت V ناحیه

 

 

می باشد هم چنین یک ناحیه کوچک به طول 4 امینو اسید این دو ناحیه را به هم متصل می کند..

 

 

را برای هر دونوع تعامل هموفیلیک و Vمطالعات تهیه نقشه عملکردی دومین ها حضور دومین

 

 

هتروفیلیک ضروری دانست.(مایکل بوون و همکاران[14]،1996)

 

 

چندین روش مبتنی بر  روش های ژنومیک[15] و پروتئومیکس[16] این پروتئین را به عنوان یک هدف مرتبط با سرطان معرفی کرده اند.این پروتئین هم چنین توسط چندین گروه به عنوان انتی ژن سطحی سلول های بنیادی سرطان کولورکتال  شناسایی شده است.(اولریچ وایدله وهمکاران ،2010 ) انتی ژن ها  مارکر های سطح سلولی اند و می توانند برای شناسایی گروه های سلولی که تشکیل دهنده یک ارگان هستند مورد استفاده قرار گیرند.این مارکرها را می توان جهت پیش بینی پاسخ به درمان ،مرتب سازی سلول های بنیادی سرطان، درمان سرطان و مرتب سازی رده های سلولی مورد استفاده قرار داد.(الوین لیو و همکاران[17]، 2004)

 

 

این پروتئین نقش مهمی در تهاجم و پیشرفت تومو در سرطان کولورکتال  دارد(جیایی وانگ و همکاران[18]،2011)

 

 

در بافت توموری انسان(مرته تونه ویجر و همکاران[19]،2010)ALCAM شکل1- 2 رنگ امیزی ایمنوهیستوشیمیایی

 

 

درطول شکل گیری ضایعات توده ، سلول های سرطانی باید به یکدیگر متصل شوند بنابراین از مولکول های چسبنده برای اینکه با هم بمانند استفاده می کنند.تومور می تواند از طریق افزایش حجم خود به ساختارهای مجاور به طور مستقیم هجوم برده و یا اینکه می توانند سایت های دور متاستاز شوند.متاستاز هنگامی رخ می دهد سلول ها از تومور اولیه جدا شده و محیط خودشان را ترک کرده ، به رگ های خونی یا لمفاتیک حمله کرده و به مکان های دور مهاجرت کنند.با توجه  در چسبندگی سلول ها می توان نقش مهمی را برای این پروتئین در ایجاد ALCAM به اهمیت

 

 

متاستاز در سرطان کولورکتال قائل بود(سالمون اوفوری و جودی کینگ[20]،2008)

1-14: اهداف پژوهش…. 36

 

 

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

 

 

2-1: مطالعات انجام شده در ایران. 38

 

 

2-2: مطالعات انجام شده در خارج از ایران. 39

 

 

فصل سوم: مواد و روش ها

 

 

3-1: محیط های کشت… 43

 

 

3-1-1: محیط کشت شکلات آگار. 43

 

 

3-1-1-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 43

 

 

3-1-1-2: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار. 43

 

 

3-1-2: محیط کشت آگار خون دار. 44

 

 

3-1-2-1: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار. 44

 

 

3-1-3: محیط کشت BHI+ supplement مایع.. 44

 

 

3-1-3-1: مواد و دستگاه های مورد نیاز. 44

 

 

3-1-3-2: روش تهیه 500 میلی لیتر محیط کشت  BHI+ supplemenمایع.. 44

 

 

3-2: کشت نمونه ها 45

 

 

3-3: فریز کردن باکتری.. 45

 

 

3-3-1: مواد و تجهیزات لازم. 45

 

 

3-3-2: روش فریز کردن. 45

 

 

3-4: شناسایی عمومی هموفیلوس آنفلونزا 46

 

 

3-4-1: تست نیاز های غذایی.. 46

 

 

3-4-2: رنگ آمیزی گرم. 46

 

 

3-4-2-1: مواد و تجهیزات لازم. 46

 

 

3-4-2-2: روش رنگ آمیزی گرم. 46

 

 

3-5: واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR). 47

 

 

3-5-1: استخراج DNA  از باکتری به روش جوشاندن. 47

 

 

3-5-1-1: مواد و تجهیزات لازم. 47

 

 

3-5-1-2: روش استخراج.. 48

 

 

3-5-2: پرایمرها 48

 

 

3-5-2-1: آماده سازی پرایمرها 49

 

 

3-5-3: برنامه PCR.. 49

 

 

3-5-4: تهیه مستر میکس PCR.. 50

 

 

3-5-4-1: مواد و تجهیزات لازم. 50

 

 

3-5-4-2: روش تهیه مسترمیکس…. 50

 

 

3-5-5: تهیه 500 میلی لیتر بافر TAE 10X.. 53

 

 

3-5-5-1: مواد و تجهیزات لازم. 53

 

 

3-5-5-2: روش تهیه بافر. 53

 

 

3-5-6: الکتروفورز محصول PCR.. 53

 

 

3-5-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 53

 

 

3-5-6-2: تهیه ژل آگارز جهت الکتروفوز. 53

 

 

3-5-6-3: روش الکتروفورز محصول PCR.. 54

 

 

3-6: استخراج PRP. 54

 

 

3-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 54

 

 

3-6-2: تهیه  ml50 محلول CTAB 0.5 M… 54

 

 

3-6-3: تهیه ml 50  محلول NaCl 0.4 M… 55

 

 

3-6-4: روش استخراج PRP. 55

 

 

3-7: اندازه گیری PRP به روش بیال. 56

 

 

3-7-1: مواد و تجهیزات لازم. 56

 

 

3-7-2: روش اندازه گیری PRP. 56

 

 

3-8:تعیین تعداد کپی cap با استفاده از Real-time PCR: 57

 

 

3-8-1: مواد و تجهیزات لازم: 57

 

 

3-8-2: شرایط واکنش: 57

 

 

3-8-3: کمیت سنجی مطلق(Absolute quantification): 59

 

 

3-8-3-1: انجام و تخلیص محصول PCR برای منحنی استاندارد. 59

 

 

3-8-3-2: تهیه منحنی استاندارد. 60

 

 

3-8-4: کمیت سنجی نسبی (Relative Quantification): 62

 

 

3-9: تعیین ژنوتیپ نمونه ها با استفاده از PCR : 62

 

 

فصل چهارم: نتایج

 

 

4-1: نتایج روش های تشخیص عمومی.. 65

 

 

4-1-1: نتایج نیاز غذایی.. 65

 

 

4-1-2: نتایج رنگ آمیزی گرم. 65

 

 

4-2: نتایج آزمون PCR.. 66

 

 

4-2-1: تایید هموفیلوس آنفلونزای کپسول دار بودن نمونه ها 66

 

 

4-2-2: تایید تیپ b بودن نمونه ها 68

 

 

4-2-3: نتیجه نهایی PCR.. 69

 

 

4-2-4: مشاهده سوش جهش یافته Hib‾ در میان نمونه ها 72

 

 

4-3: نتایج سنجش PRP  به روش بیال. 72

 

 

4-4: نتایج Real-time PCR.. 73

 

 

4-4-1: کمیت سنجی نسبی: 74

 

 

4-4-2: کمیت سنجی مطلق: 77

 

 

4-5: نتایج تعیین ژنوتیپ: 82

 

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

 

 

5-1: بحث و نتیجه گیری.. 84

 

 

5-3: پیشنهادات… 87

 

 

منابع  …   89

 

 

خلاصه انگلیسی.. 98

 

 

فهرست جداول

 

 

جدول 1-1: نیاز گونه های مختلف هموفیلوس به فاکتورهای مختلف به فاکتورهای X و V   7

 

 

جدول 1-2: بیوتایپ های هموفیلوس آنفلونزا 8

 

 

جدول 3-1: لیست پرایمرها برای تایید Hib.. 48

 

 

جدول 3-2: برنامه PCR.. 50

 

 

جدول 3-3: مواد PCR.. 52

 

 

جدول3-4: پرایمرهای اولیگونوکلئوتیدی استفاده شده برای Real time PCR.. 58

 

 

 

جدول3-5: مواد واکنش برای Real-time PCR.. 61

 

 

جدول3-6 : برنامه واکنش Real-time PCR.. 61

 

 

جدول 3-7: پرایمر های مورد استفاده برای تعیین ژنوتیپ نمونه های منتخب… 63

 

 

جدول 3-8: برنامه دمایی واکنش PCR برای پرایمرهای K  و L.. 63

 

 

جدول 4-1: لیست نمونه ها و  نتایج PCR.. 70

 

 

جدول 4-2: میزان PRP نمونه های هموفیلوس آنفلونزا تیپ b.. 73

 

 

جدول 4-3 : نمونه های منتخب و میزان PRP. 74

 

 

جدول4-4: کمیت سنجی نسبی ژن rpoB و قطعه IS106 توسط Real-time PCR.. 75

 

 

جدول4-5: کمیت سنجی نسبی ژن rpoB و ژن capb توسط Real-time PCR.. 75

 

 

جدول4-6: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه rpoB.. 78

 

 

جدول 4-7: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه capB.. 78

 

 

جدول 4-8:  نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه IS1016. 78

 

 

جدول4-9: نتایج کمیت سنجی مطلق (تعداد کپی) جایگاه های rpoB, IS1016 و capB 79

 

 

جدول 4-10 : تعداد کپی جایگاه های capb و IS1016  نسبت به جایگاه تک کپی rpoB 80

 

 

فهرست تصاویر

 

 

شکل1-1: انتشار باسیل های گرم منفی، هموفیلوس و سایر باکتریهای نرمال و سخت رشد. 5

 

 

شکل 1-2: تست نوارهای X ، V و XV.. 7

 

 

شکل 1-3: ساختار پلی ساکارید های کپسولی هموفیلوس آنفلونزا (تیپ های a-f). 10

 

 

شکل 1-4: تظاهرات کلینیکی بیماریهای با عامل Hib بصورت درصد. 14

 

 

شکل 1-5: کشورهایی که از سال 1997 تا 2012 به برنامه واکسیناسیون علیه Hib پیوستن   18

 

 

شکل 1-6: نقشه ژنتیکی حلقوی Haemophilus influenza Rd.. 20

 

 

شکل 1-7: ساختار ژنتیکی جایگاه cap در هموفیلوس آنفلونزا سروتایپ های a,b,c,d,e,f. 21

 

 

شکل 1-8: جایگاه cap و ژن های تشکیل دهنده 24

 

 

شکل 1-9 : درخت تکاملی سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا 26

 

 

شکل1-10 : تفاوت های بین ژنوتیپ I و II در جایگاه cap. 28

 

 

شکل 1-11: نحوه اتصال نشانگر سایبرگرین.. 30

 

 

شکل1-12: مکانیسم عمل SYBR Green به عنوان عامل متصل شونده به DNA.. 31

 

 

شکل1-13: رسم منحنی استاندارد. 33

 

 

شکل 3-1: ویال های آماده برای PCR روی یخ.. 52

 

 

شکل 4-1: رشد باکتری در حضور دیسک XV  و عدم رشد در حضور دیسک X و V.. 65

 

 

شکل 4-2: رنگ آمیزی گرم نمونه ها نشان دهنده کوکوباسیل های گرم منفی.. 66

 

 

شکل 4-3: نتایج PCR برای ست پرایمر A و B 67

 

 

شکل 4-4: نتایج PCR برای ست پرایمر C  و D.. 69

 

 

شکل 4-5: مدل های پیشنهادی برای جایگاه capb  در نمونه های انتخاب شده 81

 

 

شکل4-6: نتایج PCR تعیین ژنوتیپ نمونه ها 82

 

 

فهرست نمودارها

 

 

نمودار 4-1: بیان نسبی capb نسبت به ژن مرجع rpoB…………………………………………………… 76

 

 

نمودار 4-2: بیان نسبی IS1016 نسبت به ژن مرجع rpoB………………………………………………….. 76

 

 

نمودار 4-3: تعداد کپی در دو جایگاه capB و IS1016 نسبت به جایگاه rpoB در نمونه ها……… 80

 

 

خلاصه فارسی

 

 

هموفیلوس آنفلونزای تیپ‌ب (Hib) از مهمترین عوامل ایجاد مننژیت باکتریال در نوزادان و کودکان می‌باشد. مهمترین عامل بیماری‌زایی این باکتری کپسول پلی‌ساکاریدی از جنس PRP می‌باشد که تولید آن تحت کنترل گروهی از ژنها می‌باشد که در جایگاهی به نام capb قرار دارند. واکسیناسیون علیه این بیماری در بیشتر کشورهای جهان انجام شده ولی ایران هنوز به طرح واکسیناسیون سراسری نپیوسته است، به همین دلیل تولید واکسن بومی هموفیلوس آنفولانزا یک ضرورت محسوب می‌شود. هدف از این مطالعه آنالیز مولکولی ژنوم باکتری برای انتخاب یک سویه بومی واکسینال می‌باشد. در این تحقیق ابتدا نمونه‌های مشکوک به روش PCR و با استفاده از 4 جفت پرایمر اختصاصی شناسایی شد، میزان PRP نمونه‌ها به روش بیال اندازه‌گیری شد، سپس تعداد کپی جایگاه cap در نمونه‌های منتخب به روش Real Time PCR و با استفاده از 3 جفت پرایمر طراحی شده برای مناطق IS1016، capb و ژن تک‌کپی rpoB با متد Abslute Quantification مشخص شد. در نهایت ژنوتیپ نمونه‌های منتخب با استفاده از دو جفت پرایمر اختصاصی مشخص شد.از میان 30 نمونه 18 مورد Hib ،11 مورد غیر از هموفیلوس آنفلونزا و یک مورد  Hib‾ تشخیص داده شد. از میان 5 نمونه منتخب دو نمونه دارای 3 کپی از جایگاه cap بوده و 3 نمونه دارای دو کپی از این جایگاه تشخیص داده شدند. در مرحله آخر تمام 5 نمونه ژنوتیپ I تشخیص داده شدند. در این مطالعه برای اولین بار در ایران تعیین تعداد کپی و ساختار ژنوم جایگاه cap در سویه‌های بومی انجام شد.

 

 

کلمات کلیدی: هموفیلوس آنفلونزا، Real time PCR، مننژیت ، Hib

 

 

فصل اول

 

 

کلیات

 

 

1-1: تاریخچه

 

 

هموفیلوس آنفلونزا برای اولین بار در سال 1892 به وسیله فایفر جدا گردید و تا اوایل دهه 1930، اکثر دانشمندان آن را عامل مولد آنفلونزای اپیدمیک می دانستند. زیرا عموماً همراه با این بیماری بدست می آمد(8). در سال 1933 مسلم گرید که عامل بیماری آنفلونزا ویروس است و این باکتری یک مهاجم ثانوی در اپیدمیها می باشد(1). البته در پاندمی های اخیری که ویروس آنفلونزا عامل آن بوده، نقش نزدیک از این باکتری با ویروس آنفلونزا دیده نشده است و بدین دلیل مسئله سینرژیسمی بین ویروس و باکتری در بیماری های انسانی ناشناخته به نظر می رسد. بنابر این نام آنفلونزا اهمیت اتیولوژیک ندارد(8). آنفلونزا معمولا منصوب به عنوان ” flu”، یک بیماری ویروسی است که بوسیله التهاب حاد مسیر هوایی ناحیه فوقانی دستگاه تنفسی مشخص می گردد. علائم، اغلب با التهاب شدید غشاء مخاط بینی، سردرد، برونشیت و درد عضلانی عمومی شدید[1] پیشرفت می کند(48).

 

 

کاملترین مطالعات توسط مارگارت پیتمن بین سالهای 1930 تا 1940 صورت گرفت ، او فیزیولوژی، بیماریزایی، مصونیت، اپیدمیولوژی و خصوصیات این باکتری را به صورت کامل شرح داد(1). نام جنس هموفیلوس از دو ریشه یونانی هم  [2]به معنای خون و فیلوس [3]به معنای دوست داشتن گرفته شده است(20) . بر اساس کتاب باکتریولوژی برِگِی[4]، 10 گونه از هموفیلوسها در ارتباط با انسانها نام گذاری شده اند که یکی از آنها گونه آنفلونزا می باشد. بعلاوه 6 گونه نیز در ارتباط با حیوانات بوده و 3 گونه نیز حالت نامشخص دارند.